Science | 识别基因功能新技术Perturb-Seq并揭示自闭症风险基因

导读

顶级期刊《Science》发布张峰等团队的最新研究进展，他们开发一种新的体内大规模遗传功能研究技术Perturb-Seq，可同时研究生物体内不同细胞类型中不同基因的功能，并筛选了几十个与自闭症相关的基因，揭示了相关的神经元和胶质细胞异常。

研究背景

人类遗传学研究发现了成千上万个基因的遗传变异与复杂人类疾病之间的关联，尤其是全外显子测序（Whole-exome Sequencing, WES）揭示了与神经系统疾病有关的功能缺失变异，如自闭症谱系障碍和神经发育延迟（Autism Spectrum Disorders and Neurodevelopmental disorder, ASD/ND）。与全基因组关联研究（Genome-wide Association Studies, GWASs）确定的常见变异相比，此类变异具有较大的效应量、高渗透性，且发生在基因编码区内，因此对疾病建模和机制研究有非常用要的参考价值。

然而，确定相关风险基因中每个位点的作用是主要的挑战。例如，ASD/ND包含了广泛的具有高度异质遗传引起的神经发育障碍，包括数百个高渗透性的从头风险新变异基因。此外，这些基因编码的基因产物的功能各异，很难排除对潜在的神经元类型、发育过程或神经发育过程中受影响的分子或基因的先验预测。由于这些风险基因很少在动物实验中研究，因此它们在大脑发育过程中的功能及作用了解甚少。由于生成和分析单个基因敲除动物模型畸形功能研究耗时长难度大，因此开发可扩展的、通用的、高分辨率的、高含量的表型分型方法来识别和鉴定体内遗传扰动对不同功能的组织或细胞的影响非常重要。

Perturb-Seq技术揭示自闭症相关基因

来自美国哈佛大学和麻省理工学院的张峰、Aviv Regev和Paola Arlotta团队合作，于2020年11月27日在顶级期刊《Science》发表了题为“In vivo Perturb-Seq reveals neuronal and glial abnormalities associated with autism risk genes”的研究长文，作者应用了一种可扩展的遗传筛选方法，在体Perturb-seq，在功能上评估了35个ASD/ND的de novo丧失功能的风险基因。他们使用CRISPR-Cas9技术，在孕期小鼠子宫内的小鼠大脑风险基因中引入移植编码，然后对出生后大脑中受扰动的细胞进行单细胞RNA测序。作者从神经元和神经胶质细胞中鉴定出细胞类型特异性和进化上保守的基因模块。结果表明，复杂的基因模块和细胞类型在整个扰动中都受到影响，代表了ASD/ND风险基因模块的关键细胞效应。

在体Perturb-Seq技术评估ASD/ND风险基因的功能

作者从最近发表的一项包含4634例的ASD/ND原发患者的WES研究中选择了ASD/ND候选基因，并对35个候选基因对ASD/ND的识别性进行了优先排序，原则上这些基因可在多种细胞类型和发育阶段起重要作用。

为了探究不同基因在ASD/ND中的作用，作者采用CRISPR-Cass9介导的基因组编辑方法优化的在体Perturb-Seq技术，将每个风险基因的突变引入孕期小鼠子宫发育中小鼠大脑的祖细胞中，然后在小鼠出生后第7天进行scRNA-Seq。

图1 在体Perturb-Seq平台示意图

免疫组织化学分析和出生后第7天的BFP阳性神经元的scRNA-seq结果都表明，Perturb-Seq载体在大脑皮层中的多种神经元和神经胶质细胞类型都有稳定表达，如星形胶质细胞、抑制性神经元、兴奋性神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞 。

图2 Perturb-Seq有效性证据

在体Perturb-Seq的特异性靶向作用，但不影响总体细胞类型组成

作者通过对18个不同的孕期小鼠队列研究表明，借助于荧光激活细胞分选技术（FACS）富集了受扰动的神经元，并与基因座中的内源性GFP阴性对照构建体对比。作者使用LOUVAIN聚类将细胞划分为主要的细胞类型并通过已知的标记基因表达进行标注，重点关注了5个主要细胞类型的ASD/ND基因表达情况。对对照组相比，ASD/ND风险基因的扰动效应对这5种主要细胞类型的影响比较小。

图3 Perturb-Seq对五种细胞类型的影响

ASD/ND基因扰动影响多种细胞类型的细胞状态

为了评估ASD/ND遗传扰动是否引起细胞状态的分子变化，作者首先定义了5中广泛的细胞类型中的都有变异的基因模块。作者首先计算每个细胞的基因表达分析得分并将线性回归模型拟合，来测试已知基因本体论基因集的表达是否收到影响。作者使用加权基因相关网络分析（WGCNA）和结构主体模式（STM）这两种方法重新确定基因模块，通过降低维度来识别具有相关表达基因集，然后评估每个扰动组细胞中的模块基因表达情况并计算其扰动效应。

图4 Perturb-Seq证实ASD/ND风险基因扰动的细胞类型特异性作用

ASD/ND风险基因Chd8和Gatad2b改变少突胶质细胞的基因模块

研究人员证实，在Perturb-Seq实验中，Chd8和Gatad2b扰动显著降低了少突胶质细胞中ODC1模块的表达。ODC1模块在少突胶质细胞前体细胞中高表达，而在定性少突胶质细胞祖细胞和新生的少突胶质细胞中低表达，表明该基因模块与少突胶质细胞的成熟有关。因此，Chd8和Gatad2b基因的扰动会改变少突胶质细胞的成熟。

图5 Chd8和Gatad2b基因对少突胶质细胞的影响

Perturb-Seq结果与自闭症患者脑组织中的表达变化相关

研究人员接下来探究了在小鼠Perturb-Seq中的实验结果能否与自闭症患者死亡后大脑中观察到的变化相似。作者通过将实验数据与自闭症大脑中snRNA-seq数据集进行比较，并使用DESeq2进行统计上保守的伪大体分析，定义了每种细胞类型中的差异表达基因，并校正了年龄、性别和患者之间的差异。结果表明，在抑制性神经元、兴奋性神经元或少突胶质细胞等3种主要细胞类型中，自闭症患者中35个ASD/ND相关基因的数据结果与小鼠Perturb-Seq数据保持一致。

图6 Perturb-Seq细胞类型特异性基因在人类大脑中是保守的

研究意义

在体Perturb-Seq技术可以用作大型基因组的系统遗传研究的可扩展工具，已在复杂组织中以单细胞分辨率水平上揭示细胞内在的功能。本文证实了Perturb-Seq在大脑发育过程中ASD/ND风险基因的研究与应用，未来也可用于多种疾病和组织。此外，在体Perturb-Seq技术发现了异质遗传病理学受影响的途径和细胞类型，指导下游研究，并未我们从遗传变体向功能性遗传体模型的完善提供了重要方法和信息。

参考资料

Jin, X., et al., In vivo Perturb-Seq reveals neuronal and glial abnormalities associated with autism risk genes. Science, 2020. 370(6520).

DOI: 10.1126/science.aaz6063