肿瘤细胞在不同生物墨水中生物3D打印后形成特定的细胞表型

恶性黑色素瘤经常被用作建立新的治疗方法的模型肿瘤。众所周知，二维(2D)培养方法不足以阐明癌症发生和发展过程中的各种过程。因此，建立明确的生物丰富的三维(3D)模型，有助于破译复杂的细胞相互作用，是一项非常有意义的工作。为了对它们的可打印性和随后的行为有一个印象，研究团队用Matrigel和两种不同类型的商业生物墨水打印了荧光标记的黑色素瘤细胞系。

总体而言，我们展示了黑色素瘤细胞在所有测试生物材料中的可印刷性，以及在14天的培养过程中印刷细胞的存活情况。黑色素瘤细胞株在各自的墨水中表现出特定的差异行为。然而，在Matrigel中，细胞能够在整个构建过程中扩散、增殖并形成致密的网络，而在以藻酸盐为基础的生物墨水中，细胞完全没有增殖。

在以甲基丙烯酸明胶为基础的生物墨水中，细胞呈簇状增殖。令人惊讶的是，用RGD或层粘连蛋白混合物修饰生物墨水并没有影响分析的细胞行为。研究结果强调了精确调整细胞外基质以适应特定3D生物打印应用的个性化要求的重要性。

关键词：黑色素瘤；三维生物打印；三维细胞培养；生物墨水；生物制造；肿瘤微环境；细胞外基质

尽管癌症治疗的可能性在不断演变，但对提供更好结果的治疗仍有巨大的需求。此外，缺乏预测新方法在患者中的有效性的方法。黑色素瘤是开发新疗法的常用模型肿瘤，它是一种高度恶性的肿瘤，起源于黑素细胞，其特征是从原发肿瘤极早、极快地转移，随后快速发展。直到今天，肿瘤形成和发展的许多方面仍然是个谜，阻碍了新方法的发展。这不仅是因为生物系统内分子过程的高度复杂性，也是由于基础研究中常用的二维(2D)细胞培养等通常简化的疾病模型。例如，现有的2D系统有助于阐明癌症的六个特征，并支持开发癌症疗法的过程。然而，它们几乎不能反映更复杂的病理生理状况，这是未来进展所必需的。

在这里，Sonja K.Schmidt团队目标是评估两种不同转移来源的黑色素瘤细胞系使用不同的商业可获得的基质的可打印性，这些基质被认为可以广泛用于3D生物打印应用。研究团队首次为黑色素瘤细胞在不同材料(包括Matrigel)中的3D生物打印提供了概念证明，并指出了使用独立于应用程序的生物墨水的可能性和局限性。实验表明，3D打印构建物中细胞的增殖和形态取决于细胞系和材料组成，而在案例中，用RGD序列或层粘连蛋白混合物修饰墨水并不会导致细胞差异。

研究使用五种不同的生物墨水来分析细胞反应、肿瘤细胞的形态和表型。Cellinks由海藻酸盐和纳米纤维纤维素组成，其中一种进一步与RGD-肽(CelLink RGD)偶联。GelXA生物墨水由甲基丙烯酸明胶、黄原胶和海藻酸盐组成，另一种则进一步与层粘连蛋白(GelXA Laminink+)偶联。之所以选择这些修饰，是因为整合素类合适受体蛋白的表达在恶性黑色素瘤中得到了很好的描述，并被发现对肿瘤的生长和进展具有重要作用。Matrigel类似于细胞外基质，由IV型胶原、层粘连蛋白、牙本质蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖和生长因子组成。在这里，我们的目的是比较自然衍生的复杂基质和人工生产的生物墨水，并确定偶联ECM-多肽对生物墨水细胞行为的影响。

研究团队打印了两种来自黑色素瘤转移瘤的不同荧光细胞系(Mel Im GFP，GFP；MV3dc，核H2B EGFP和DsRed2；打印参数如表1所示)。

研究团队必须根据不同的生物墨水使用不同的打印压力，但所有五种材料都是可打印的(图1A)。在培养过程中，这两种细胞都没有表现出任何宏观上可见的变化。GelXA-Inks在肿胀的基础上表现出一些微小的变化，而Matrigel无法保持网格结构，在14天的培养期间，主要基于细胞增殖而显示出较高的体积增加(图1A)。在所有结构中，打印后一天细胞均匀分布(图1B)。在14天的培养时间里，没有观察到细胞下沉，但细胞在多个层次的结构上分布良好。

图1.生物墨水的可印刷性和细胞分布。用CelLink+生物打印机分别用CelLink生物墨水、CelLink RGD、GelXA、GelXA Laminink+或Matrigel打印面积为1cm2、三层高、含105个细胞/毫升的构建体。(A)时间点d0、d7和d14处的细胞加载3D打印构件的代表性宏观图像。(B)3D打印后1天，黑色素瘤细胞系Mel Im GFP(绿色)和MV3dc(红色/绿色)在各自墨水中的代表性荧光显微镜图像。比例尺表示 200μm。

众所周知，在3D打印过程中，由各自生物墨水的粘度引起的剪切力是细胞的一个关键因素。然而，显微镜图像显示荧光信号，代表3D打印过程后的活细胞(图2A)。如上所述，分析了第一天的细胞数量(图2B)。与能够很好地应对印刷过程的GelXA-墨水相比，在基于海藻酸盐的细胞墨水中，Mel Im GFP的活细胞数量显著减少(p≤0.05)。在Cellinks中可以检测到许多存活的MV3dc细胞，在GelXA中有较高的活细胞率。与未经修饰的墨水相比，GelXA Laminink+中的MV3dc活细胞数量减少了约三分之二。在两种细胞系中，Matrigel细胞数最多(p≤0.05)。

图2.黑色素瘤细胞在生物墨水中的存活情况。(A)3D打印后一天，每个细胞系Mel Im GFP和MV3dc的两张具有代表性的荧光显微镜图像。这两个黑色素瘤细胞株都在所有生物墨水中的生物打印和交联过程中存活下来。刻度条代表100m。(B)在Mel Im GFP当天对生物墨水中每毫米活细胞的定量显示，两种基于CelLink的墨水中的活细胞数量都很低，而在基于GelXA的墨水中活细胞的比例更高，并显示Matrigel中的活细胞数量显著最高。MV3dc显示在所有材料中都有适当数量的活细胞，其中Cellinks和GelXA Laminink+的活细胞数量最少，Matrigel的活细胞数量最高。*p≤0.05

由于所用的五种基质为细胞提供了不同的黏附线索，研究团队预计黑色素瘤细胞会在材料中形成不同的形状。有趣的是，绝大多数单细胞在材料中保持圆形，只有一小部分细胞在限定的生物墨水中扩散(图3A)。对打印后第1、2、4天的突起长度进行了分析，因为从那时起细胞开始增殖，不再能确定单细胞的扩散情况(图3B)。

在所有五种测试的生物墨水中，在MV3细胞中观察到的YAP/TAZ活性都很低(图3C)。在七天的培养过程中，只有极少数单个细胞在细胞连接中显示出荧光信号。在都含有整合素结合基序的GelXA生物墨水和Matrigel中，我们检测到更多的细胞传递绿色荧光蛋白信号。然而，无论是RGD偶联基质中的细胞，还是与层粘连蛋白偶联的GelXA中的细胞，与各自未修饰的生物材料中的细胞相比，荧光细胞的数量都没有增加。

由于Mel Im GFP和MV3dc被证明在生物打印过程中幸存下来，我们分析了不同生物墨水中细胞随时间的增殖情况。与Matrigel、基于海藻酸盐(CelLink)和基于明胶甲基丙烯酸酯(GelXA)的生物墨水相比，随着时间的推移，细胞表现出明显的增殖行为(图4A，B)。

图4.培养14天后，肿瘤细胞在生物墨水中的增殖。(A)典型的荧光图像，显示在用CelLink生物墨水、CelLink RGD、GelXA、GelXA Laminink+和Matrigel打印后，Mel Im GFP和MV3dc在d4、d7和d14的增殖。Mel Im GFP和MV3dc在CelLink Bioink和CelLink RGD中几乎没有生长或增殖，但在GelXA和GelXA Laminink+中形成了不规则的团簇。在Matrigel中，细胞增殖迅速，Mel Im GFP成簇生长，随时间融合在一起，而MV3dc细胞在整个材料中形成密集的链状网络。标尺表示200微米。(B)通过测定每个时间点至少三个荧光图像的平均灰度值强度来量化增殖，以对数绘制以强调Matrigel中两种细胞的最强增殖。经统计比较，第14天Matrigel的平均灰度值与当天其他材料的平均灰度值有显著差异。在比较第4天或第7天时也观察到了同样的意义。

总而言之，研究团队实验揭示了两个黑色素瘤细胞株在四种商业生物墨水和Matrigel中的可印刷性。这两种细胞株在印刷过程和随后的两周培养中都存活了下来，根据基本材料成分的不同，表现出不同的增殖和扩散行为。与研究团队的预期相反，细胞存活、形态和增殖并没有从RGD或层粘连蛋白的材料修饰中受益。在相同的环境条件下，观察到两种黑色素瘤细胞系在细胞存活、形态和增殖方面的差异，说明了开发合适的生物墨水的困难。

研究团队结论是，3D生物打印需要精确了解打印过程中的细胞和材料属性、细胞与材料的相互作用以及细胞和材料的行为，以便在开始开发有效的3D模型甚至组织之前，找出如何根据某些线索控制某些细胞。进一步研究嵌入在结构中的细胞中发生的分子信号转导将是非常有意义的，以便定义参与信号转导的分子，从而更接近于能够控制和操纵定义的3D结构中的细胞反应。