Cell Stem Cell观点 | 基于多能干细胞的细胞治疗，未来可期

撰文 | 咸姐

责编 | 兮

来源：京都大学iPS細胞研究所

细胞疗法是一种将活细胞注射、移植或植入患者体内，旨在修复疾病起源和发展的机制的治疗方法。细胞治疗利用干细胞、祖细胞、原代细胞或干细胞衍生物来替代或修复受损的器官或组织，这些细胞可以通过静脉注射，直接转移到受累区域，或者从患者自身组织中招募来诱导自我修复。而多能干细胞（PSC）的自我更新和分化潜能使其成为细胞疗法最有利的细胞来源【1】，目前应用于临床研究的人类PSC（hPSC）主要有两类——胚胎干细胞（ESC）和诱导多能干细胞（iPSC）。

1998年，James Thomson团队首次报道了人类ESC（hESC）【2】，此后其逐渐被探索用于各种疾病和损伤的细胞治疗，如脊髓损伤、年龄相关黄斑变性和1型糖尿病。然而hESC的临床应用一直存在着两个主要问题——伦理问题和免疫排斥，因此，2007年人类iPSC（hiPSC）应运而生【3】。从此以后，科学家们一直试图将hiPSC应用于患者，其中一些已经在进行临床试验（图1）。

图1使用PSC进行细胞治疗的临床试验

随着研究的深入，现如今对实现PSC细胞治疗的期望达到了有史以来的顶峰，但是，其临床转化仍然遇到了许多问题。2020年10月1日，来自日本京都大学的Shinya Yamanaka教授（2012年诺贝尔生理或医学奖获得者）在Cell Stem Cell上在线发表观点“Pluripotent Stem Cell-Based Cell Therapy—Promise and Challenges”，聚焦于基于PSC的细胞治疗目前面临的最主要的三大挑战——致瘤性、免疫原性和异质性，回顾了二十年来针对这三个问题的研究，并讨论提供潜在的解决方案，以期加速基于hPSC的细胞疗法的发展。

致瘤性

PSC的无限增殖潜能无疑是一把双刃剑。它可以为各种类型的细胞移植提供大量的细胞，但是移植后的继续扩增将导致肿瘤，其致瘤原因可以分为以下3类：

1. 不正确分化扩增模式诱导的畸胎瘤或其他肿瘤

畸胎瘤的形成是hiPSC和hESC细胞移植中最严重的问题。如果未分化或未成熟的细胞仍保留在从hPSC分化的最终细胞产物中，即使是很少量的残留，也会由于不正确的分化模式而导致畸胎瘤或其他肿瘤。因此，研究人员花费了大量的时间和精力来设计实验方法，以防止畸胎瘤和其他肿瘤由于错误的模式而产生。在细胞移植治疗中，能移植的细胞越少，肿瘤发生的风险就越小。减少畸胎瘤发生风险的第一步就是建立有效的体外定向分化，其次就是利用严格的纯化程序去除未分化和其他非目的细胞，如抗体纯化。

除了残留的PSC，分化细胞的持续扩增也可能诱导肿瘤。因此仔细严格的筛选iPSC细胞系对于移植安全非常重要。此外，抑制细胞自我更新的关键信号通路已被列为抑制未成熟神经祖细胞致瘤性的另一个方法。同时，研究人员也提出了可作为双重保障的方法，即在受体和移植的hiPSC之间故意错误HLA等位基因，这样当出现意外细胞增殖时，就可以通过停用免疫抑制剂来消除移植细胞。

2. 重编程因子诱导肿瘤

这是iPSC细胞移植所特有的风险。iPSC产生过程中的四种重要的重编程因子均与致瘤性相关，尤其是c-Myc。而其他一些为了增加重编程效率的因子，如p53的显性阴性突变体等也会致瘤。因此，在hiPSC用于临床细胞治疗时，要谨慎地排除这些致癌转基因的整合。

3. 基因异常引起的肿瘤

基因异常引起肿瘤的风险在hiPSC、hESC和其他任何需要在移植前进行体外扩增的细胞中都很常见。体外扩增培养的细胞不可避免地会引起基因改变，如染色体异常、拷贝数变异、单核苷酸突变等。一般情况下，染色体异常，如染色体缺失、重复或重排，可以通过核型分析来监测，从而确保出现异常的细胞可不被应用于细胞治疗。而比这更难评估且更具有争议的是较小范围的基因改变，如单核苷酸变异（SNV）和拷贝数变异（CNV），这些变化需要二代测序及相关技术才能监测。PSC中的基因改变可以分为两种类型，一类是在细胞系分化之前就存在的，另一类是在细胞系分化后发生的。前者的等位基因频率不是50%就是100%，因此全基因组测序（WGS）可以检测到大部分这些变化。相比之下，后者的等位基因频率较低，容易被忽视。虽然通过改变数据分析中使用的算法可以检测到这些微小的变化，但这样的检测条件降低了严谨性，并会导致大量假阳性。另外一个关键的问题则是iPSC重编程本身是否具有诱变性。有研究给出了肯定的回答，但是这仍是个有争议的问题，需要被进一步探讨和解决。

当然，还有一个重要的问题在于，当你发现PSC中一个癌基因的突变时，如何说服大家它真的可以增加癌症风险，从而阻止PSC的细胞治疗呢？同样的突变是否会影响多能细胞对不同疾病的治疗也仍然需要进一步探讨。而且目前对于癌症基因的定义尚未形成共识，必须承认的是，并非所有非同义突变的癌基因都是致病的。此外，即使是健康的个体也存在着癌基因的多重突变，从而增加了风险分析的复杂性，同时一些同义突变和基因间突变也被发现可以致病，也进一步增加了基因组分析的复杂性。

免疫原性

免疫排斥反应是细胞治疗的另一个关键问题。虽然存在争议，但是有临床研究表明在规避免疫应答方面，由患者自身细胞产生的iPSC为多能干细胞进行自体移植是一个理想的选择。然而，目前出于时间和金钱成本考虑，同种异体移植比自体移植方式更受青睐，尤其是一些急性疾病如心脏衰竭和脊髓受损等。

传统的克服异种移植的免疫排斥反应的方法是免疫抑制剂。在一些免疫赦免的组织，如中枢神经系统和眼睛，免疫抑制剂的使用时间可以缩短，但是免疫赦免可被损伤或疾病所破坏，也可能随着年龄增长而衰弱。而非免疫赦免组织的异种移植患者终身都将使用免疫抑制剂。

减少免疫排斥反应的另一种方法是HLA单倍型匹配，这是目前广泛应用于造血干细胞移植的方法。但是，即使使用了HLA匹配，似乎免疫抑制剂仍是需要的，不过我们可以期望通过匹配HLA减少免疫抑制的剂量和持续时间以造福患者。近些年来，随着基因编辑技术，尤其是CRISPR技术的出现，PSC中的HLA基因可以被失活，由此产生了新的减少异种移植免疫排斥的方法——HLA“隐身”（图2）。HLA单倍型匹配和HLA“隐身”各有其利弊。前者避免了基因编辑存在的脱靶效应，但是其对NK细胞攻击的敏感性可能低于仅依赖于单一配体的HLA“隐身”方法。而HLA“隐身”方法的一个最大的优势在于其利用少量的细胞系即可覆盖整个世界人群，这就使得一个单一的hiPSC细胞系就有可能成为通用的细胞来源。这不仅减少了细胞治疗的时间和金钱成本，也减小了细胞系之间的异质性。

图2 HLA“隐身”法减少异种移植免疫原性

异质性

没有任何两个PSC细胞系是完全一样的，每个细胞系在形态、生长曲线、基因表达和分化成不同细胞系的倾向上都不同，即PSC异质性，是其后续应用（包括细胞治疗）的主要障碍之一。不论是小鼠ESC还是hESC，亦或是hiPSC，遗传变异和表观遗传修饰均是其异质性的主要原因。为了克服异质性，研究人员试图将hPSC的启动状态（在含有成纤维细胞生长因子2的常规培养条件下，hPSC的基因表达和表观遗传状态与植入后的外胚层相似，此状态即为启动状态）转化为初始状态（类似囊胚或着床前外胚层内的细胞团）。目前有多种方法被报道用来诱导hPSC的“初始”或基态多能性，其中之一是结合使用生长因子的化学抑制剂。初始状态的hPSC面临着两个很重要的问题：其一在于其基因的完整性。初始状态的hPSC更容易出现染色体异常或含有更多SNV，需要更深入的研究来解决这个问题。此外，寻找多能性的其他中间状态也是具有深远意义的。其二在于基因印迹丢失。初始状态hPSC的一个特征是整体低甲基化，在重新分化回到启动状态时会被重新甲基化，然而大多数印迹基因在重新启动的细胞中会被抹去，从而产生不良后果。

综上所述，人类多能干细胞在细胞治疗和其他应用方面的潜力是巨大的。虽然本文的作者提出的将hPSC延伸产物应用于临床的主要困难和挑战是巨大的，但是目前也不乏一些令人鼓舞的成功案例激励着研究的继续，数百名科学家正继续以高超的技能去克服其余的障碍。相信在不久的将来，多能干细胞技术将成为一项真正的临床选择，在全球范围内为病人带来福音。

https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.09.014

1. Ella Buzhor , Lucy Leshansky, Jacob Blumenthal et al. Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases.Regen Med.2014; 9(5):649-72.

2. Thomson, J.A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S.S., Waknitz, M.A., Swiergiel, J.J., Marshall, V.S., and Jones, J.M. (1998). Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.Science282, 1145–1147.

3. Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., and Yamanaka, S. (2007). Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.Cell131, 861–872.