科普 | 样本制备完成了,可流式细胞术语还没弄清楚?

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  前 言

  流式细胞术( Flow cytometry, FCM)是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。与一般的技术相比,流式细胞仪分析时会涉及到各种参数,对于刚入门的我们,常常搞得焦头烂额。如下图(来自网络)仅仅流式分析数据图都是多种多样(一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等)。所以,今天就为大家科普一下,流式细胞仪中那些常见术语。

  

  

  一维直方图&二维点图

  

  等高图&密度图

  01

  流式细胞仪常见术语

  1. 设门(gate):

  划定某一区域的细胞群体,对其单独加以分析或分选。举例来说,如下左图,以FSC为横坐标,SSC为纵坐标,圈出想进行分析的细胞主群(设门),双击圈内,看FL4(APC)为横坐标,FL2(PE)为纵坐标,进行分析。下中图为阴性对照,由此可以圈出阴性群的范围,在下右图中就可以划分出APC单阳、PE单阳、APC&PE双阳的细胞群。

  

  2. FL1、 FL2、 FL3、FL4通道:

  在某些机型的流式细胞仪中存在,是指不同的荧光通道。举个例子,我们用FITC/PE双标记的细胞,在488nm的激光激发下,这两种荧光染料分别发出波长不同的绿色和橙色荧光,然后将发出的荧光再通过滤光片分开,对应的是不同的波长的滤光片,一般在FL1通道是530nm的滤光片,在FL2通道是575nm的滤光片,这样就可以把在一起的荧光分开了。

  3. FL2-W FL2-A FL2-H :

  流式细胞仪检测信号时,每一个细胞通过激光,机器的探头都会检测到一个荧光信号,在内部产生一个电脉冲信号(波),这个信号机器记录为一个峰值,每一个峰值都有三个参数,高度(H),宽度(W)和曲线下面积(A),H 和W都是直接测出的,而A是根据机器的设置就算得出。

  4. APC、PE、PE-Cy7、PerCP-Cy5.5等:

  这些名词均为常见的荧光素,在受激发后能产生荧光。

  5. 调补偿:

  若两种以上的荧光素的发射光谱之间存在重叠,则需要调补偿。这就意味着一种荧光素发出的光可能被另一种荧光素的检测器检测到。调补偿主要指在流式细胞多色分析中,纠正荧光素发射光谱重叠的过程,去除干扰荧光信号。如下为补偿调节原则:

  ①用于调节补偿的标本必须单染。

  ②样本必须可以染出一群阳性和一群阴性,以比较它们之间的平均荧光强度。

  ③可以使用同一荧光的另一抗体替换目的抗体来调节补偿(例如在稀有细胞检测时)。

  ④使用表达强度高的抗体来调节补偿。

  ⑤用来调节补偿的抗体必须与实验用的抗体荧光素一样(例如不能用FITC调节GFP的补偿)。

  ⑥串联染料的抗体如果批号不同,需要再次做补偿。

  ⑦阴性和阳性细胞的自发荧光水平必须一致。

  ⑧有些抗原表达弱,阳性群不明显,例如IFN-γ-PE,可以用补偿微球代替细胞。

  6. MFI值:

  即为平均荧光强度。每个细胞经过流式细胞仪检测都会有一个相对强度的荧光值。阴性细胞没有特异性荧光,也会发生很微弱的自发荧光,因此有很小的荧光强度;阳性细胞的特异性荧光强度是阴性细胞荧光强度的几百甚至几千倍。MFI就是把所有细胞的荧光强度相加再除以细胞数,就是所有细胞荧光强度的一个平均值。一般来说,百分比越高MFI就高,百分比低相应MFI就低,有时候两个样本百分比相处不多看不出差别时,MFI就能很好地反应这种微弱的差异。

  7. 染色:

  用带有不同荧光基团的抗体分别结合细胞上不同的抗原。荧光素偶联抗体的标记(染色)包括表面染色和胞内染色:

  ①表面染色

  

  ②胞内染色

  

  8. 基线偏移:

  通过增加随机的高斯正偏移把一些低水平信号的对数数据从比较低的数字通道上移上来,方便数据间的分析。

  02

  常见的技术指标

  1. 仪器的分辨率:

  分辨率是衡量仪器测量精度的指标,通常用变异系数CV (Coefficient of Variation)表示。DNA 流式分析中的分辨率(或精确性)非常重要,因为细胞群体之间DNA 含量的细微差别可能有显著的生物学意义。通常,分辨率由标准微球DNA 分布中的G0/G1 峰的变异系数CV来反映(CV%=(SD/Mean)×100)。仪器因素(如液流、光路调试和光学元件等)、样本制备和染色过程带来的人为因素都可能影响检测的精确性。评估真正的生物学意义上的DNA 含量差别因而具有更重要的价值。如何最大限度地减少样本制备和仪器因素带来的变异是DNA 分析条件最佳化的根本所在。DNA 直方图中峰的CV 越低,质量越好,从图中可能获得的信息越多。新鲜标本的CV 常比石蜡包埋的标本好。新鲜标本的CV 常≤3%,而石蜡包埋的标本CV 则取决于组织病理实验室的具体操作方法,通常到≤5%。当G1 峰的CV≥8%时,不再合适估计S 期比例。

  2. 荧光测量灵敏度:

  灵敏度的高低是衡量仪器检测微弱荧光信号的重要指标,一般以能检测到单个微球上最少标有FITC 或PE 荧光分子数目来表示,一般现在FCM 均可达到<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差>5%即可区分。

  3. 前向角散射光(FSC, Forward Scatter)检测灵敏度:

  前向角散射光检测灵敏度是指能够检测到的最小颗粒大小,一般目前商品化的FCM 可以测量到0.2-0.5μm 左右。

  4. FCM 分析速度:

  分析速度以每秒可分析的细胞数来表示,当细胞流过光束的速度超过FCM 仪器响应速度时,细胞产生的荧光信号就会被丢失,这段时间称为仪器的死时间(Dead time)。死时间越短,我们就说这台仪器处理数据越快,一般可达到3000个/秒~6000个/秒左右,FACS Calibur 的分析速度为10000个/秒,大型机已达到每秒几万个细胞。

  5. FCM 分选指标:

  分选指标主要包括:分选速度、分选纯度及分选得率。分选速度指每秒可提取所要细胞的个数,目前常用的台式分选仪器BD公司生产的FACS Calibur的分选速度为300个/秒,BD大型机的流式细胞仪最高分选速度可达每秒上万个细胞。分选纯度指被分选出细胞所占的百分比,一般台式机和大型机的分选纯度均可达到99%左右。分选得率是指被分出细胞与原来溶液中该细胞的百分比。通常情况下,分选纯度和得率是互相矛盾的,同一样品,纯度提高,得率降低,反之亦然。这是由于样品在液流中并不是等距离一个接着一个有序地排着队,而是随机的,因此,一旦两个不同细胞挨得很近时,在强调纯度和收获率不同条件下,仪器会作出取舍,因此,选择纯度还是得率要视具体实验要求而定。

  6. 背景(噪声、荧光、散射)Background (noise, fluorescence, scatter):

  当样品流中没有颗粒时却仍存在的信号(背景噪声是限制荧光检测灵敏度的一个因素)。背景信号会有不同的主要来源:当激光器关闭,或流动室没有光激发时,检测器噪声是主要的背景信号来源。对于光电倍增管(PMT),检测器背景噪声被称为暗电流,主要来自光电阴极的电子的随机发射。对于光电二极管和其他固态检测器,主要来源于倍增器。荧光噪声源包括:水和光学元件的拉曼散射来自样品或鞘流中未结合的荧光染料、试剂或污染物的荧光光学组件的荧光。

  03

  Tips

  ①控制好孵育时间:荧光淬灭操作中的孵育时间一定要严格,孵育时间过长会导致荧光淬灭,如将试管放入冰中,可以延迟淬灭;

  ②注意染色顺序:遇到多种荧光染色时,可能会因为染色顺序的不同而导致荧光强度不同。处理方法:提前进行预实验,尝试多种顺序,选择最佳染色顺序
③合适的染色方案:选择不合理的染色方案也会导致荧光信号太弱。处理方法:提前进行预实验,设计好最佳染色方案
④做好阴性对照及同型对照:试验细胞阴性对照可以显示细胞基准的荧光水平。同型对照则是为了查看抗体非特异性结合的水平。选择同型对照需要注意采用相同物种、相同亚类、相同染料、相同浓度,否则,检测的时候会出现乱七八糟的同型对照结果。
⑤选择合适的抗体:为表达最弱的抗原选择染色指数最高的荧光素。根据使用的流式细胞仪性能、激光器、滤光片种类来选择。对于多色实验,需选择发射光谱重叠小的染料。

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