重磅！用植物模型可研究人类神经系统疾病的发病机制！

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2018年7月27日， Cell 杂志在线发表了来自澳大利亚莫纳什大学（Monash University）Sureshkumar Balasubramanian课题组题为“ RNA-Dependent Epigenetic Silencing Directs Transcriptional Downregulation Caused by Intronic Repeat Expansions ”的研究论文。人类Friedreich共济失调疾病是一类神经系统相关疾病，由于FXN (Frataxin)基因的第一个内含子中含有 GAA 三核苷酸重复序列的“扩增”，导致基因的沉默。而该研究通过研究拟南芥的IIL1基因的第三个内含子中的GAA三核苷酸重复沉默基因的机制，发现 GAA 三核苷酸重复扩增会导致24-nt siRNA（siRNA）和异染色质组蛋白修饰在IIL1基因处积累增加，并通过RdDM途径依赖的表观遗传修饰如DNA甲基化来下调转录。故该研究结果为人类Friedreich共济失调疾病的可能发病机制提供了一种新的见解。

研究背景：

核苷酸重复序列扩增 已被证明与人类40多种的疾病的发病机制相关，其中大部分为神经系统相关疾病。最先发现，也是最常见的是三个核苷酸重复序列扩增，现在又发现了四，五，六，甚至十二个核苷酸重复序列扩增。 核苷酸重复序列扩增可以发生在编码区，如编码区域的重复扩增，例如在亨廷顿氏病中看到相对较少数量的CAG三核苷酸重复（~40重复），并且主要导致编码蛋白质中的多谷氨酰胺延伸，其可能是有毒和致病的；同时也可以在非编码区，如Friedreich共济失调或脆性X综合征中的非编码区域的扩增是大规模的（大约2,000次重复），普遍认为非编码区域中扩增影响基因功能的机制似乎在不同疾病之间是不同的（见下图）。

图1 核苷酸重复序列扩增引起的神经系统疾病（Handbook of Clinical Neurology）

Friedreich共济失调（FRDA）患者大部分起因于其细胞内第9号染色体（9q13-q21.1）编码FXN (Frataxin)蛋白的基因中第一个内含子中的 GAA 三核苷酸重复序列的“扩增”有关。FXN (Frataxin)蛋白涉及到向线粒体内输送“铁”，防止线粒体中的中间肽酶对铁在线粒体内的集聚作用。正常人群中，该位点的GAA重复序列单位大约6~34个。但是，Friedreich's ataxia遗传病患者的GAA数目可以在67~1700,以800~1000个GAA重复单位为最常见。这种“扩增”后的GAA重复序列 严重减少了 FXN(Frataxin)蛋白的表达，而FXN (Frataxin)蛋白广泛分布在中枢神经系统中的脊髓、小脑和大脑皮层，以及非神经系统中的心脏、骨骼肌、肝、肾和胰脏细胞中。故该病表现为肢体进行性共济失调，伴锥体束征，发音困难，深感觉异常，脊柱侧突，弓形足和心脏损害等特征，因此，设法增加FXN的表达作为FRDA的潜在治疗选择。

现有研究表明FXN基因座的表观遗传沉默可能与反义FXN转录相关。该基因同时转录有义和反义转录本，则原则上可能产生引发RNA干扰的基因沉默的小RNA。然而，FXN位点的小RNA现在仍然没有检测到。虽然，这些研究结果表明GAA/TTC重复扩增可能通过表观遗传基因沉默导致基因转录下调，但仍不清楚这是如何发生的。

有趣的是，该研究组以前发现在拟南芥生态型Bur-0中，异丙基质异构酶1（IIL1）基因的3号内含子中同样含有大量的GAA/TTC重复扩增序列（> 400重复），并且也同样严重降低了IIL1基因的转录水平，使得该物种在高温下表现出生长缺陷，称为“不规则受损的叶子”（iil）表型，而Bur-0背景的Natural Suppressor 15（NS15，IIL1-NS15）植物，部分丧失重复扩增（约100次重复），及Col-0中只含有23次重复（IIL1-Col），以上两种植物都没有iil表型（如下图），说明了该重复扩增序列的数量与基因沉默程度相关。然而，重复扩增如何导致IIL1基因座的转录下调仍然没有答案。此外，从中得出拟南芥中IIL1的内含GAA/TTC重复扩增与导致人类FRDA的FXN的重复扩增具有相似之处。两者都是内含子重复扩增导致基因表达的减少。此外，两者的重复扩增都表现出体细胞变异性和遗传不稳定性，故表明至少有一些潜在的机制可能在整个物种中是保守的，因此，研究重复扩增如何导致IIL1基因座的转录下调有利于了解FRDA发病机制！

图2 Bur-0与Col-0，NS15的表型区别和IIL1基因的内含子重复扩增序列数量相关

研究方法与结论：

第一，先确认了三核苷酸重复扩增序列诱导IIL1转录下降与表观遗传变化相关。研究表明与NS15和Col-0对照相比，Bur-0植物中IIL1基因内含子重复扩增序列的异染色质组蛋白H3K27me3修饰的积累增加，而活性染色质组蛋白H3K36me3修饰水平下降，这表明IIL1-Bur-0基因座以三核苷酸重复扩增序列依赖的表观遗传沉默（见下图）。另一方面，通过将介导H3K27me3的PRC2复合体成分，HLP1和CLF通过RNAi敲低后，显示出对iil表型的抑制。

第二，确认三核苷酸重复扩增序列能产生24nt siRNA，并且对基因沉默是必须的。 研究发现与Col-0或NS15相比，在23°C和27°C时，在Bur-0中的IIL1基因座的24nt siRNA数量显著增加,与表型一致。同时，发现在27°C生长的Bur-0植物与23°C相比，24nt siRNA扩散到重复序列的上下游。综上，在Bur-0中IIL1 24nt siRNA的积累是温度依赖性和基因座特异性增加，与重复扩增序列的次数相关。进一步通过敲除Bur-0中负责产生24nt siRNA的DCL3蛋白后，发现该位点的H3K36me3水平显着增加，并抑制了iil表型（见下图）。因此，DCL3蛋白及其产生的24nt siRNA是三核苷酸重复扩增序列介导基因表达下调所必须的。

第三，确认在Bur-0中IIL1基因的siRNA通过RdDM途径介导基因的沉默。RdDM途径是植物中从头介导DNA甲基化的主要途径之一（详细请点击最新研究揭示RdDM途径在植物种子发育中的作用，Nature Genetics | 最新研究揭示了DNA甲基化的起始新机制！）。通过敲低Bur-0中所有RdDM途径中的核心蛋白，发现几乎都显示出对iil表型的抑制，说明了RdDM途径对于由重复扩增引起的IIL1的转录下调是必需的。由于RdDM途径主要影响DNA甲基化，研究发现相对于Col-0，Bur-0的IIL1-基因的5'区域直至外显子8高度甲基化，包括重复扩增，特别是CHG和CHH的DNA甲基化。

综上所述，研究结果表明，与人类中的FRDA一样，GAA/TTC三核苷酸重复扩增引起的转录下调与IIL1基因处的抑制性表观遗传标记的增加相关。同时该研究还证明了IIL1处的GAA/TTC重复扩增导致24-nt siRNA的积累增加，并且是温度依赖性和与iil表型相关的增加。另一方面，该研究进一步显示siRNA通过RdDM途径介导的DNA甲基化，并随后导致异染色质组蛋白修饰如H3K27me3的水平上升，这一过程在植物基因内含有内含子GAA/TTC重复扩增序列引发的基因沉默中起着重要作用（如下图）。

iPlants: 鉴于早期在FXN发现了反义转录物和组蛋白修饰，该研究结果表明，RNA依赖性转录基因沉默途径应进一步评估作为FRDA中FXN表达的表观遗传沉默的可能机制。由于物种间某些保守机制的存在，以拟南芥为模型同样也可以作为研究人类疾病的发病机制提供另外一种见解，而由于拟南芥研究更容易进行遗传筛选，获得突变体，故拟南芥的基础研究值得重视！同时该研究也为我们提供了在植物基因内含子中的GAA/TTC三核苷酸重复扩增沉默基因的分子机制，故值得十分推荐！