【亮点关注】Cell Discovery:轻链调节重链构象改变针对甲型流感病毒的单克隆抗体的保护特性

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  2019年4月16日,高福院士团队在Cell Discovery上发表了题为“Light chain modulates heavy chain conformation to change protection profile of monoclonal antibodies against influenza A viruses”的文章,探索了使用轻链修饰来开发针对甲型流感病毒和其他新兴病毒的广泛保护性单克隆抗体的策略,为理解抗原识别中轻链的分子基础提供了重要线索。

  

  流感病毒是一种严重的病原体,威胁着全球公共健康并感染人类和动物种群。在上个世纪,已经记录了四次流感大流行导致许多人死亡:1918年和2009年的H1N1、1957年的H2N2、以及1968年的H3N2。虽然已具有针对甲型流感病毒和乙型流感病毒的疫苗,但由于流感病毒株的包膜蛋白(血凝素,HA;神经氨酸酶,NA)的快速抗原性变异,季节性流感疫苗提供的保护是有限的。因此,迫切需要通用疫苗和治疗性抗体来抵抗那些快速变化的流感病毒。

  具有广泛中和人单克隆抗体为甲型流感病毒感染者的治疗到来了希望。大多数针对甲型流感病毒的广泛中和抗体结合保守的茎区或血凝素的受体结合腔,并且相互作用由重链支配。然而,轻链对抗原的作用很小或没有直接接触。进一步的结构研究表明,轻链通过影响重链的局部构象来调节中和谱,而不是与抗原直接相互作用。

  高福研究团队等人基于二代测序技术,通过对H7N9感染患者的不同重链和轻链的筛选,获得了H3-进化枝具有中和活性的人单克隆抗体AF4H1K1,该人单克隆抗体可识别所有2组甲型流感病毒的血凝素糖蛋白。结构研究表明,轻链通过影响重链的局部构象来调节中和谱,而不是与抗原直接相互作用。这些发现为理解抗原识别中轻链的分子基础提供了重要线索,并探索了特别是使用轻链修饰来开发针对甲型流感病毒和其他新兴病毒的广泛保护性单克隆抗体的策略。

  1、通过NGS技术筛选抗体

  将来自H7N9感染的患者的外周血单核细胞(PBMC)的B细胞受体(包括λ-轻链,κ-轻链和重链)的可变区基因库扩增,测序并用NGS分析。根据互补决定区3(CDR3)序列的丰度和长度,选择3个重链V基因和5个轻链V基因( 表1)和15个配对的IgG抗体产生。在这些配对的IgG中,发现只有一个带有重链H1和轻链K1的配对IgG可以在体外中和H3N2 IAV而不是H7N9,该MAb被命名为AF4H1K1。

  

  Table 1 Isotype and CDR3 sequence analysis for the selected three heavy chains and five light chains from an H7N9-infected patient

  2、AF4H1K1可以中和H3进化树IAV

  进一步的,研究人员在体外验证了了AF4H1K1对IAV其他亚型的中和活性。结果显示,AF4H1K1可以中和H3-进化树中多株甲型流感病毒:包括H3,H4和H14,50%抑制剂浓度(IC50)可达13.2μg/ml至189.0μg/ ml。AF4H1K1可识别在第2组IAV感染的细胞表面表达的所有HA蛋白亚型,但不识别在第1组IAV感染的细胞中表达的HA蛋白。AF4H1K1以高亲和力结合大多数第2组HA:对于H3,H4,H14,H7和H10HA,KD值分别为4pM至49nM。相比之下,AF4H1K1对H15HA的亲和力低得多,KD值约为1.8μM。

  

  Table 2 Neutralization activity of AF4H1L1, AF4H1K1, and AF4H1/FI6L against a panel of IAVs from different groups

  3、AF4H1K1/H3和AF4H1K1/H4复合物的晶体结构

  为了确定AF4H1K1识别的表位,研究人员解析了AF4H1K1 Fab与1968 H3N2大流行分离株(H3-AC/68)和H4N6鸭分离株(H4-CZ/56)的复合物的晶体结构和3.8分辨率结果显示,两种配合物的总体结构非常相似。AF4H1K1 Fab片段以相似的方向结合茎和残留酯酶结构域的H3HA和H4HA,其中Fab分子与HA茎大致正交。在两种复杂结构中,重链主导与HA分子的相互作用。AF4H1K1重链的结合足迹涉及HA1和HA2亚基,而轻链只接触HA2亚基的两个氨基酸Gln42和Asp46,它们也参与重链相互作用。在AF4H1K1重链中,重链CDR1(HCDR1),HCDR2,HCDR3和 重链框架区3(HFR3)环参与H3和H4 HA分子的相互作用。相比之下,只有轻链CDR1(LCDR1)的Ser30, Ser31和Tyr33以及LCDR3的Gly93有助于H3 HA表位识别,而LCDR3环不参与识别H4分子。

  

  Fig. 1: AF4H1K1 binding to the fusion subdomain of the HA trimer.

  4、AF4H1L1和AF4H1K1分子的结构比较

  AF4H1L1不能结合来自组2的HA,例如H3,H4,H14,H7,H10和H15,如表面等离子体共振(SPR)测定所示。与结合试验一致,AF4H1L1不能中和来自第1组或第2组的IAV(表2)。为了理解为何只有轻链K1可以与重链H1匹配以获得HA结合和中和活性,作者解析了另一个AF4H1L1的Fab结构。结果表明,LCDR3对HCDR3的构象变化有很大的贡献,而HCDR3又决定了MAb的结合和中和活性。该结果表明,轻链通过调节重链构象在MAb活性中具有非常重要的作用,即使轻链与抗原几乎没有直接相互作用。

  此外,研究者将K1 CDR3残基引入L1以产生一个突变体AF4H1/L1CDR3m。迄今为止,该突变体未显示任何HA结合或IAV中和活性。此外,AF4H1/FI6v3L,一种来自AF4H1K1的重链和来自FI6v3的轻链的杂合MAb,在体外扩展了H3-和H7-进化枝IAV的中和宽度。 FI6v3轻链可通过将其长LCDR1环插入邻近的HA单体中来增加AF4H1 / FI6v3L的结合和中和谱。

  基于AF4H1L1,AF4H1 / L1CDR3m,AF4H1K1和AF4H1 / FI6v3L的结合和中和结果以及结构分析,总结出整个轻链在确定抗原结合和病毒中和中具有关键作用。然而,单独的LCDR3不足以增强改变IgG行为的强度。

  

  Fig. 2: The interaction of AF4H1K1 VL and VH with H3 HA and H4 HA.

  Fig. 3: Structural comparison between AF4H1K1 and AF4H1L1.

  

  Fig. 4: Comparison of HA fusion subdomain-interacted domains of VH and VL from AF4H1K1 and FI6v3.

  4、AF4H1K1的预防和治疗功效

  为了评估AF4H1K1 IgG 动物体内对H3亚型流感病毒的保护作用,研究者拯救了重组病毒H3-rAC/68(HA来自H3N2 A/Aichi/2/1968,剩余7个基因片段来自H1N1 A/Puerto Rico/8/1934)。该重组病毒不会在感染的小鼠中引起死亡,但在病毒感染的动物的肺中复制良好。因此,使用肺中的病毒滴度作为确定AF4H1K1的保护功效的指标,并基于肺中的病毒复制确定50%小鼠感染剂量(MID50)。预防保护效果研究中,在攻击前1天用15mg/kg AF4H1K1处理的小鼠的肺中的病毒滴度分别在感染后3天和5天减少约500倍和10,000倍。相反,阴性对照抗埃博拉 MAb 13C6 对病毒滴度没有任何明显的影响。治疗性保护效果研究中,AF4H1K1也显示出抑制 H3-rAC/68 复制的能力。在病毒攻击后4,24和48小时后,用AF4H1K1或13C6IgG处理H3-rAC/68感染的小鼠。在 3dpi 时,AF4H1K1治疗组肺部48h的病毒滴度低于对照组,而 5dpi 时,所有3个AF4H1K1治疗组在不同时间点显着抑制病毒复制。这些数据表明AF4H1K1在体内具有针对H3-rAC/68感染的预防和治疗功效。

  

  Fig. 5: AF4H1K1 showed prophylactic and therapeutic activities against H3 and H7 IAVs.

  ABSTRACT

  The isolation of human monoclonal antibodies with broadly neutralizing breadth can provide a promising counter measure for influenza A viruses infection. Most broadly neutralizing antibodies against influenza A viruses bind to the conserved stem region or the receptor-binding cavity of hemagglutinin and the interaction is dominated by the heavy chain. The light chain, however, contributes few or no direct contacts to the antigen. Here we report an H3-clade neutralizing human monoclonal antibody, AF4H1K1, which recognizes the hemagglutinin glycoproteins of all group 2 influenza Aviruses. This human monoclonal antibody has been obtained through the screeningby pairing different heavy and light chains from an H7N9-infected patient based on the next-generation sequencing technology. Further structural studies revealed that light chains modulate the neutralizing spectrum by affecting the local conformation of heavy chains, instead of direct interaction with the antigen. These findings provide important clues to understand the molecular basis of light chains in antigen recognition and to explore the strategies in particular of the use of light chain modification to develop broadly protective monoclonal antibodies against influenza A viruses and other emerging viruses.

  Haixia Xiao, Tianling Guo, Mi Yang, Jianxun Qi,Chaobin Huang, Yuanyuan Hong, Jinjin Gu, Xuefei Pang, William Jun Liu, RuchaoPeng, John McCauley, Yuhai Bi, Shihua Li, Junxia Feng, Hailiang Zhang, XupeiZhang, Xishan Lu, Jinghua Yan, Liling Chen, Yi Shi, Weizhi Chen & George FuGao. Light chain modulates heavy chain conformation to change protection profile of monoclonal antibodies against influenza A viruse. Cell Discovery, volume5, Articlenumber:21 (2019).

  本期编辑:Annabella

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