消化道微生物样本取样秘籍，你get了吗

消化道是由一系列不同的群落生境如口腔、胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠以及粪便组成的，每一生境具有处于平衡状态的独特菌群。这些看不见摸不着的微生物结构简单，但与人和动物的生命活动密切相关，也是近年来的研究热点之一。

一个好的研究课题，应当从好的样品开始。同样，在基因测序领域，想要得到好的测序结果，首先需要得到高质量的核酸样本。因此样品采集是研究者们普遍关心的问题。下面将由奥维森的实验达人给大家分享一份超实用的干货。

口腔微生物

英国伦敦国王学院牙科研究所William Qade曾说：“健康的人类口腔中包含着巨量的并且种类繁多的微生物，包括病毒、真菌、原生动物和细菌。其中细菌量是最大的，每毫升唾液有1亿个细菌，整个口腔中的细菌种类超过600种”。根据部位和微生物特点不同，口腔微生物的采集方式分为：1. 拭子（口腔拭子/咽拭子）；2. 唾液；3. 牙菌斑三大类 。

01 拭子取样

1.1 口腔拭子

1）采样前30分钟禁食、禁烟酒等；

2）准备一杯清水（约150ml），将清水含入口中，充分洗漱口腔约10秒，重复2-3次。

3）将拭子伸入口腔，使拭子头充分接触左侧口腔内壁，上下牙床处粘膜，用适当力度上下擦动并旋转拭子15-20圈。用同样方法在右侧口腔内壁及上下牙床粘膜处进行另一根拭子的采样。

4）将拭子装回采集管（内含生理盐水或者PBS缓冲液），做好标记，放置-80°C冰箱保存。

1.2 咽拭子

3）将采集对象舌头外拉，使悬雍垂尽可能向外牵引。同时，将拭子越过舌根到咽后壁或者悬雍垂后侧，反复擦拭15次以上，避免接触舌、口腔粘膜和唾液。

02 唾液取样

3）用舌尖抵住上颚或下颚齿根以富集唾液，向采集管中轻轻吐入唾液，直至液体唾液（非气泡）达到2ml 以上。采集完毕，放置-80°C冰箱保存。

03牙菌斑取样

3）用棉卷隔湿所采集的牙齿，再以无菌生理盐水冲洗牙面，用无菌挖匙或探针采集窝沟菌斑或唇颊面菌斑；以牙线置于两邻牙之间，紧贴牙面采集邻面菌斑。采集后放入含有保存液的保存管内，做好标记，放置-80°C冰箱保存。

胃部微生物

胃是食物停滞的第一个部位，也是细菌繁殖的重要场所。胃为酸性环境，在进食的过程中还会带入空气至胃内，因此优势菌主要为耐酸菌和兼性厌氧菌。在胃部微生物研究中，反刍动物瘤胃因其独特的功能和结构，成为胃部微生物研究的热门部位。

一般来说，瘤胃液微生物（非胃瘘管动物）取样方法如下：

1）固定反刍动物，用开口器张开口器。

2）将橡胶胃管通过开口器圆孔插入胃内，抵达贲门处有抵触感，继续往下至瘤胃可排出酸性气体。

3）将胃管接入吸引唧筒，胃内容物可自行逆流至采样玻璃瓶中。

4）用100ml以上的为内容物通过四层纱布过滤，滤液采用10000g离心5min，沉淀用少量生理盐水溶解后放置-80°C冰箱保存。

不推荐使用的简易方法：在动物反刍时，用手由口腔掏出食团，榨取瘤胃液。

肠道微生物

肠道菌群是全身最大的微生物集聚地，与疾病健康、生理心理都有莫大的关系，近十年全球肠道微生物研究相关文献每年增速达30%。通常，十二指肠微生物比较少，到了空肠和回肠，微生物数量不断增加，盲肠和结肠是体内细菌量最大的部位。根据研究部位不同，肠道微生物采集主要分肠道内容物、肠粘膜、粪便和肛拭子四大类。

01肠道内容物

1）将实验对象进行死亡处理，然后在无菌环境下将整个肠道移出。

2）选取所需肠段，用无菌手术刀或者其他无菌器材刮取肠道内容物，根据动物大小不同，刮取0.1-1g不等量的肠道内容物。

3）若不能立即进行提取，将内容物进行液氮速冻后放置-80°C冰箱保存。

02肠粘膜

2）选取所需肠段置于4° C预冷Hank' s液，剔除肠系膜。

3）将肠腔剪为长约3 cm小段，纵向剖开肠管，用预冷Hank' s轻轻漂洗3遍，刮取肠黏膜组织后液氮速冻后放置-80°C冰箱保存。

03粪便

粪便是常用的肠道微生物的研究对象，虽然粪便所有细菌是来自于消化道，但其微生物的分布情况类似于盲肠和结肠，而不能代表整个消化道。

粪便采集相对简单，收集好大于0.2g以上的新鲜粪便，装入无菌管中，立即放置-80°C冰箱保存。

04肛拭子

对于排便困难或者特殊研究目的，可采用肛拭子取样。

1）采用肥皂水、水以及酒精对肛门周围进行清洗。

2）用无菌甘油水或者无菌生理盐水润湿肛拭子。

3）将润湿完毕的肛拭子插入肛门括约肌以上位置与直肠粘膜接触后轻轻旋转15次圈以上，然后取出，立即进行提取或者放置-80°C冰箱保存。

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